Nachweis von Antikörpern gegen Granulozyten und Lymphozyten
Zum Nachweis von Granulozytenantikörpern hat sich in internationalen Workshops eine Kombination mehrerer Methoden als Goldstandard durchgesetzt.
Beim Granulozytenagglutinationstest (GAT) nutzt man die Fähigkeit granulozytärer Antikörper,
(Test-)Granulozyten direkt zu aggregieren, d.h. „Agglutination” ist eigentlich nicht die korrekte, jedoch historisch gewachsene Bezeichnung.
In diesem Test werden Testgranulozyten mit dem zu untersuchenden Serum auf einer Mikrotiterplatte inkubiert.
Die Aggregation benötigt einige Stunden und wird an einem Umkehrmikroskop beurteilt. Insbesondere Antikörper gegen das Antigen HNA-3a, das eine bedeutende
Rolle bei der Auslösung einer TRALI-Reaktion spielt, lassen sich in diesem Test am besten nachweisen.
Andererseits
induzieren nicht alle Granulozytenantikörper eine Aggregation. Im Granulozytenimmunfluoreszenztest
(GIFT) werden daher mit Hilfe eines fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpers
membrangebundene Antikörper nachgewiesen. Die Auswertung erfolgt mittels
Durchflußzytometer oder im Fluoreszenzmikroskop. Die Auswertung mit dem
Fluoreszenzmikroskop ist zwar aufwendiger und benötigt viel Erfahrung,
ist aber nach den Ergebnissen der Internationalen Workshops für Granulozytenimmunologie
vorzuziehen. Die Mikroskopie ermöglicht es nämlich im Gegensatz zur Durchflußzytometrie,
falsch positive Fluoreszenzsignale, die von zerstörten Zellen stammen,
als solche zu erkennen. Ferner kann man im Mikroskop durch das Fluoreszenzmuster
häufig membrangebundene Granulozytenantikörper von einer unspezifischen
Anlagerung von Immunkomplexen über Fcγ-Rezeptoren unterscheiden.
Der GIFT lässt durch die Wahl des Sekundärantikörpers auch die Unterscheidung
zwischen IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern zu.
Um schließlich granulozytenspezifische Antikörper von HLA-Antikörpern unterscheiden zu können, wird noch ein Lymphozytenimmunfluoreszenztest (LIFT) durchgeführt. Der Testaufbau ist dem GIFT analog, die Auswertung erfolgt hier mittels Durchflußzytometer, da die Lymphozyten sehr stabil sind und in der Mehrzahl keine Fc-Rezeptoren tragen.
Die hierzu notwendigen typisierten Testzellen müssen wegen ihrer kurzen Haltbarkeit in vitro für die Untersuchungen jeweils frisch aus Spenderblut isoliert werden. Die Antigenspezifität der in den Suchtests identifizierten Antikörper wird, wenn möglich, in einem glykoproteinspezifischen ELISA (Monoclonal Antibody Immobilization of Granulocyte Antigens = MAIGA) bestimmt. Dies ist prinzipiell mit allen Antigenen bzw. zugrundeliegenden Proteinen möglich, für die monoklonale Antikörper zur Immobilisation des Antigens an die Mikrotiterplatte zur Verfügung stehen (HNA-1, -2a, -4a, -5a). Lediglich HNA-3a-Antikörper können nicht nachgewiesen werden, weil keine monoklonalen Antikörper zur Verfügung stehen. Da der ELISA sehr aufwendig ist, eignet er sich nicht als Antikörpersuchtest.